吐温-80，又名聚山梨酯-80，是一种非离子型表面活性剂，结构式为C₂₄H₄₄O₆(C₂H₄O)_n。吐温80常作为裂解剂、增溶剂、乳化剂和蛋白稳定剂等，广泛应用于口服、非胃肠道和局部给药的制剂。作为常用的制剂辅料，吐温-80在小分子固体及液体制剂中被广泛应用。不仅如此，由于吐温-80具有稳定蛋白，提高溶解性等作用，这类辅料也长期应用于生物药的制剂产品中。

图1. 吐温-80结构示意图

由于给药途径、剂量等各方面的差异，吐温-80在制剂中的用量差异巨大，例如：美国FDA批准药物非活性成分数据库中注射剂的每单位剂量最大使用为0.02%~58.5%（w/v）不等。因其静注毒性中等、胃肠道摄取毒性中等、对眼有刺激性，为实验性致癌物，对生殖有影响，所以有必要对其残留进行准确测定。此外，在制剂反向工程及新药制剂开发的工作中，需要有快速、准确的分析方法来对产品中的吐温-80进行精确定量分析。这就对方法的灵敏度、线性范围以及广泛适用性提出了非常高的要求。

目前，中国药典2020版三部收录的数种生物制品中对吐温-80残留有明确规定，且收录了吐温-80残留通用检测方法-紫外分光光度计法。但该方法操作复杂耗时长且专属性差，很难满足药典指导原则对于含量测定的方法的要求。此外，使用液相色谱对吐温-80进行分析的报道也较多，但因为吐温-80本身无较强紫外吸收，导致检测方法的灵敏度较差。同时，因为缺乏针对该类辅料专用的液相色谱柱，使用常规反相柱开发出来的方法往往存在峰形差，分析时间长，抗干扰能力弱等问题。

基于上述原因，上海熙华药业有限公司推出了基于AcclaimTM Surfactant系列专用型色谱柱的吐温-80快速检测方法。该方法具有专属性好、灵敏度高、重复性好、准确度优异、分析时间短等优点，可以用于各类制剂，尤其是生物药中吐温-80含量及残留的快速检测放行。最为关键的，该方法采用等度洗脱方式，完美匹配CAD、ELSD等质量型检测器，避免了后者在使用梯度方法时因B相升高而导致的基线上升及空白干扰问题。

二、实验部分

2.1 试剂

异丙醇：HPLC级；乙酸：分析纯；乙酸铵：分析纯

2.2 仪器及条件

高效液相色谱仪：Waters Alliance HPLC；检测器：CAD；方法时间：6分钟

图2  吐温-80加标溶液色谱图及流动相信息

三、结果与讨论

3.1重复性

图3结果表明本方法重现性和精密度良好。

图3  吐温-80对照溶液图

3.2灵敏度

如图4、图5所示，可知该方法的检测限和定量限约为0.3 μg/mL和2.2 μg/mL。值得注意的是，在传统的吐温分析中，通常需要设计大梯度增加B相比例将其吐温洗脱。由于CAD、ELSD这类检测器的响应与流动相挥发性相关，容易导致基线急剧上升及波动，干扰低浓度目标物的检测。由于本方法采用等度洗脱，完美解决了低浓度下的检测基线波动问题，从而能够获得较高的检测灵敏度和重现性。

图4  1.0 μg/mL浓度下吐温-80色谱图

图5  5.0 μg/mL浓度下吐温-80色谱图

3.3线性

如图6所示，在CAD检测器上，吐温-80在0.16-2.4 mg/mL范围内呈线性相关，拟合结果R² = 0.9997。

图6  吐温-80标准曲线（0.16-2.4 mg/mL）

3.4准确度

在生物制剂中分别加入不同浓度的吐温-80进行加标回收率实验，回收率在99.4%-100.1%之间(图7)。

图7  1.6mg/ml、2.0 mg/ml、2.4mg/ml三个水平吐温-80加标回收率情况

四、结论

综上所述：本方法的专属性好、准确度和精密度良好、工作曲线相关性优异、灵敏度高、分析时间短，可以作为生物药制剂产品中吐温-80含量及残留测定的优选解决方案。另一方面，由于本方法采用等度洗脱方式，解决了传统梯度方法中因B相剧烈变化导致的基线波动问题，大幅提高了方法的灵敏度，同时节约了分析时间及溶剂消耗，非常适用于大通量的样品检测工作。