寡核苷酸类（oligonucleotide）药物，是一种短链核苷酸，通过干预靶基因表达，达到治疗疾病的目的。该类药物被认为将带来“小分子药、抗体药之后的第三次制药行业浪潮”，因而受到广泛关注。

自1998年Vitravene（用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎）上市以来，该类药物的有效性和安全性问题就争议不断，主要原因在于寡核苷酸类药物由于结构和作用机理的特殊性，存在先天性的稳定性差、递送效率低，靶向性差等缺点。随着化学修饰、GalNac递送系统及其他靶向作用药物载体技术的成熟与运用，以及寡核苷酸药物在罕见病、慢性病等领域的突破，各大公司纷纷通过引进或自研方式布局该类药物的市场。其中，聚乙二醇修饰的脂质体载体，作为一种修饰后的脂质体载体，可以屏蔽机体对脂质体的识别和摄取，延长脂质体的体内循环时间，大大提高了其对寡核苷酸类药物的转运效率^【1】。

考虑到载体技术在寡核苷酸药物的开发与生产过程中具有普适性，且制剂中药物载体，尤其是高分子载体的存在对于其含量检测具有一定的干扰。因此，上海熙华药业开发了一种以限进介质技术CAPCELL PAK MF（一种结合了SEC和反相分配的色谱柱技术，通过SEC作用使样品中的大分子组分快速洗脱，同时应用反相分配的机理对小分子组分进行保留和分离。分离原理如图1所示）为核心的反相色谱方法，用于检测PEG-脂质体载体制剂中寡核苷酸药物的含量（如图2所示）。

图1 CAPCELL PAK MF限进介质色谱原理示意图

该方法能够最大限度地减少高分子载体对寡核苷酸含量检测的干扰，且具有重复性好、灵敏度高、线性及准确度优良等特点。此外，结果显示，该方法对于不同长度的寡核苷酸类药物也具有良好的分离效果，可以用于其降解物或工艺杂质的分析检测。

图2 核酸-PEG脂质体载体制剂样品溶液色谱图（图中9.333 min为025bp核苷酸的峰）

高效液相色谱仪：Agient 1260 HPLC或Waters Alliance HPLC

色谱柱：CAPCELL PAK MF C8（2.1*150 mm, 5.0 µm）

核苷酸对照品：由生工生物工程(上海)股份有限公司提供

图3结果显示本方法的重现性和精密度良好。

图3 连续6针025bp制剂溶液图谱（PEG-脂质体在本方法中无紫外吸收）

如图4所示，可以得知该方法的检测限和定量限分别大致为1 µg/mL（图A）和5 µg/mL（图B）。

图4 灵敏度溶液（图A和B中025bp核苷酸的浓度分别为1 µg/mL，5 µg/mL）

如图5所示，30-70 µg/mL范围内线性相关性良好。

图5 025bp核苷酸的线性

结果如图6所示，分别配制不同浓度的核酸制剂样品进行回收率实验，回收率在99~101%之间，证明该方法能够有效降低高分子载体对于分析结果的干扰。

图6 40 µg/mL、50 µg/mL、60 µg/mL三个浓度水平下的制剂方法回收率

结果如图7所示，分别配制相同浓度不同碱基长度的核苷酸样品进行分离实验，可以看出在CAPCELL PAK MF C8色谱柱上，不同长度的寡核苷酸均有良好的分离效果。

图7 015 bp、017 bp、019 bp、021 bp、023 bp、025 bp六个不同碱基长度下核酸的分离情况

通过上述结果，可知该方法的抗载体干扰性优良，专属性、灵敏度、工作曲线相关性优异，且有着较高的准确度与精密度，可以作为生物药制剂产品中核苷酸含量及有关物质测定的优选解决方案。

Reference

1. Ambegia, E. et al. Stabilized plasmid–lipid particles containing PEG–diacylglycerols exhibit extended circulation lifetimes and tumor selective gene expression. Biochim. Biophys. Acta 1669, 155–163 (2005).